Спермограмма: исследование эякулята.

ВВЕДЕНИЕ

Одной из актуальных и широко обсуждаемых проблем андрологии следует признать состояние репродуктивного здоровья мужчин. Это обусловлено постоянно меняющимся процессом адаптации организма человека к действующим на него экзо- и эндогенным факторам. При этом установлено, что наиболее качественным показателем репродуктивной функции является способность к оплодотворению и к зачатию, а также состояние здоровья будущего поколения.

За последнее время в литературе появился ряд сообщений, свидетельствующий о проведении исследований репродуктивного здоровья населения в связи со сложной демографической ситуацией, обсусловленной резким увеличением численности населения, снижением рождаемости, а также значительным ростом заболеваний, передающихся половым путем, и рядом других факторов.

При этом отмечено, что проблема бесплодного брака приобретает все большую социальную и медицинскую значимость. Данные же по распространенности мужского бесплодия носят относительный характер, поскольку не все пациенты обращаются за консультацией и лечением. Низкий процент обращаемости зависит также от уровня санитарно-просветительной работы и от развития специализированной помощи в данном регионе.

Нарушение оплодотворяющей способности мужчин оказывается причиной бесплодного брака в 40-50% наблюдений. Эта проблема с каждым годом приобретает все более острый характер, поскольку в настоящее время до 15% браков являются бесплодными, а по некоторым данным одна из пяти супружеских пар.

Известно, что одним из важнейших методов в оценке функционального состояния половых желез и плодовитости мужчин является исследование спермы. Используя этот показатель как индикатор качества репродуктивного здоровья, появились работы в США и странах Европы об имеющейся тенденции к снижению фертильности спермы по сравнению с результатами, полученными с интервалом в 10-40 лет. Очевидно, что значительная часть причин бесплодия (30-35%) приходится на долю нарушения сперматогенеза. Являясь нередко приобретенным состоянием, патоспермия имеет значение и как причина малодетных браков. Кроме того, приблизительно 15% из бесплодных супружеских пар страдают бесплодием неясной этиологии. Поэтому адекватная лабораторная диагностика имеет большое значение в лечении бесплодия, а особенно важную роль в формировании окончательного диагноза играют специальные методы исследования. Среди них первое место занимает исследование эякулята как объективный показатель патологических изменений генеративной функции.

ПОЛУЧЕНИЕ И ОБЩИЕ СВОЙСТВА ЭЯКУЛЯТА

Решающее значение для диагностики функциональных нарушений половых желез и суждения о плодовитости мужчин имеют макроскопические, микроскопические, биохимические и иммунологические исследования эякулята. Методы получения эякулята почти всеми исследователями унифицированы. Чаще всего эякулят получают путем мастурбации, раздражением спинального эякуляторного центра с помощью введенных в прямую кишку электродов. Используется также вибромассаж полового члена.

Необходимо помнить, что даже субфебрильная лихорадка, отмечавшаяся в предшествующие исследованию 3 месяца, может вызвать серьезные изменения в эякуляте вплоть до азооспермии.

Способы получения сперматозоидов

• Мастурбация. Сперма должна быть собрана в посуду с широким горлом.
• Посткоитальная сперма. Собирается в презерватив без спермицидов и любрикантов. Доставка полученной спермы не позднее 1 часа. Транспорт должен быть осуществлен при температуре тела.
• Посторгазменная моча. При ретроградной эякуляции (заброс спермы в мочевой пузырь через несомкнутый сфинктер). Показанием является анэякуляция или малообъемная эякуляция. При этом предусматривается оральное ощелачивание мочи или катетеризация мочевого пузыря с введением специальных сред для максималього сохранения условий жизнедеятельности сперматозоида.

Оптимальным считается получение спермы путем мастурбации в лабораторных условиях.

Эякулят получают после 3-5-дневного полового воздержания. В это время не рекомендуется употреблять алкоголь, лекарственные препараты, посещать финскую баню, а также делать массаж предстательной железы и семенных пузырьков. Доставлять эякулят в презервативе или получать прерыванием полового акта недопустимо – это ведет к искажению результатов.

Эякулят должен быть получен полностью, так как различные его порции содержат неодинаковое количество сперматозоидов.

Следует предупреждать пациентов о том, чтобы по возможности при получении эякулята не терять первой его порции. Установлено, что первая треть эякулята содержит 75% общего количества сперматозоидов, а сперматозоиды в оставшемся объеме обычно имеют худшую подвижность, что может привести к ошибкам в диагностике.

Эякулят собирают в чистую, сухую, предварительно прогретую до температуры тела стеклянную посуду, желательно градуированную.

Полученный эякулят доставляется в лабораторию в подмышечной впадине (для поддержания температуры) в течение 30-40 мин после эякуляции.

К микроскопическому исследованию следует приступать через 30-40 мин после получения эякулята, так как в течение этого времени происходит его разжижение. При повышении температуры жизненные процессы сперматозоидов усиливаются и небольшой запас собственной энергии быстро истощается.

Постепенное охлаждение эякулята тормозит метаболизм в сперматозоидах, резкое – может вызвать холодовой шок. Шок парализует дыхание, ведет к торможению фруктолиза, и сперматозоиды становятся неподвижными. В таком случае согревание или добавление теплого 5% раствора глюкозы может привести к восстановлению их подвижности. При сомнительных результатах необходимо производить повторные исследования эякулята.

Полученный эякулят помещают в термостат при температуре 37° С, не подвергая охлаждению, так как при перепаде температуры изменяется подвижность сперматозоидов. Исследование начинают через 1 час после эякуляции, предварительно отметив время разжижения, которое в норме наступает через 5-30 мин после эякуляции, под влиянием фермента гиалуронидазы.

Полный анализ эякулята (развернутая спермограмма) включает макроскопическое, микроскопическое и биохимическое исследование семенной жидкости.

Макроскопическое исследование эякулята

Макроскопическое исследование эякулята сводится к определению его объема, вязкости, запаха, цвета и кислотности.

Объем. Количество эякулята в норме находится в пределах 2-5 мл, но бывают значительные колебания. Он зависит от количества секрета, придатков яичек, семявыносящих протоков, семенных пузырьков, предстательной железы, желез уретры. Объем спермы менее 2 мл (при условии, что эякулят собран полностью) указывает на нарушения в добавочных половых железах. Это чаще всего обусловлено недостатком стероидных (андрогенов) либо гонадотропных гормонов.

Физические и химические показатели спермоплазмы:

В этих случаях также можно думать о сужении и деформации семенных пузырьков и семявыносящих путей. Среднее количество эякулята у здоровых мужчин составляет 3,7 мл.

Избыточное количество эякулята (7-8 мл) обычно сопровождается уменьшением конентрации сперматозоидов.

Запах. Спермин, вырабатываемый предстательной железой, придает свежему эякуляту характерный запах, напоминающий запах цветов каштанов. Отсутствие характерного запаха указывает на отсутствие секрета предстательной железы. При длительном хранении в обычных условиях в эякуляте развивается микрофлора и появляется гнилостный запах. При гнойно-воспалительных процессах запах изменяется в зависимости от микрофлоры.

Цвет. При большом количестве сперматозоидов цвет эякулята молочный, опалесцирующий в проходящем свете, при малом же количестве – прозрачно-голубоватый. При азооспермии эякулят, как правило, бывает прозрачным. Примесь более или менее значительного количества лейкоцитов (пиоспермия) придает эякуляту гнойный вид, а эритроцитов (гемоспермия) – красноватый вид, что указывает на патологический процесс в предстательной железе и семенных пузырьках. При гемоспермии, в зависимости от ее выраженности, эякулят окрашивается от розового до интенсивного красного цвета.

Желтоватый оттенок появляется при воспалительном процессе в дополнительных половых железах.

Время разжижения. Расценивается как время, прошедшее от момента эякуляции до полного разжижения эякулята, то есть вся масса эякулята становится гомогенной, что устанавливается путем размешивания эякулята стеклянной палочкой. Увеличение времени разжижения связано с недостаточным содержанием в секрете предстательной железы ферментов – фибринолизина и фиброгеназы.

Вязкость. Сразу же после эякуляции начинается процесс свертывания, а затем в течение 10-30 мин идет процесс разжижения. Чтобы не ошибиться в определении числа и оценки подвижности сперматозоидов, следует выждать полного разжижения эякулята. Определение вязкости имеет большое значение при уменьшении подвижности сперматозоидов. Считают, что повышенная вязкость эякулята и наличие в нем слизи снижают скорость движения сперматозоидов. Степень вязкости определяют длиной нити, образующейся между поверхностью эякулята и стеклянной палочки.

Эякулят тщательно размешивают стеклянной палочкой, которую затем медленно извлекают и отмечают на глаз длину нити, тянущейся за палочкой до разрыва.

Нормальной считается вязкость при длине нити 0,1-0,5 см. При воспалительных заболеваниях предстательной железы и семявыносящих путей количество слизи и вязкость эякулята могут возрастать. Повышение вязкости сочетается с увеличением времени разжижения и наблюдается при наличии в эякуляте значительного количества слизи, являющейся продуктом воспалительных процессов добавочных половых желез.

Реакция эякулята. pH эякулята составляет в среднем 7,3-7,7. Щелочная реакция обеспечивает нормальную подвижность сперматозоидов, позволяет им быстро миновать неблагоприятную среду влагалища с кислой средой (pH 4,0-4,2) и достигнуть шейки матки, секрет которой имеет рН 7,5.

Реакция эякулята вариабельна у мужчин, но у одного и того же пациента относительно постоянна. pH эякулята определяют с помощью индикаторной бумаги или рН-метра. Индикатором для определения рН эякулята может служить 0,1% спиртовой раствор нейтрального красного (2 объема) + 0,1% спиртовой раствор метиленового синего (1 объем).

Каплю эякулята смешивают с каплей индикатора и по цветной реакции судят о рН: 6,2 – интенсивно-фиолетовый, 6,4 – фиолетовый, 6,6 – светло-фиолетовый, 6,8 – серо-фиолетовый, 7,0 – темно-серый, 7,2 – серый, 7,4 -– серо-зеленый, 7,6 – светло-зеленый, 7,8 – зеленый. рН эякулята у здоровых мужчин колеблется в пределах 7,6-7,8.

МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЯКУЛЯТА

Для микроскопического исследования эякулята пользуются обычным микроскопом с увеличением 120х (объектив 8, окуляр 15) до 400х (объектив 40, окуляр 10) или люминесцентным микроскопом ЛЮМАМ-И-2.

Исследования производят при комнатной температуре (не ниже +20° C). Для обзорной микроскопии используют нативный препарат, который готовят из свежего эякулята следующим образом. На чистое предметное стекло после перемешивания в стаканчике пипеткой наносят каплю исследуемой спермы и покрывают покровным стеклом. Обзорная микроскопия позволяет получить первое впечатление о количестве, качестве и подвижности сперматозоидов.

Сперматозоид представляет собой длинную, 58-67 мкм, клетку со жгутиком. В нем различают 3 части: головку, тело и хвост. Форма головки овальная, заостренная в переднем конце. Большая часть головки занята ядром. Цитоплазма в виде тонкой оболочки окружает ядро. Головку с телом связывает шейка – наиболее тонкая часть сперматозоида. Хвост тонкий, его длина 50-60 мкм.

На передней части спермия находится акросома, перфорирующая оболочку яйцеклетки. Акросома является специфической только для сперматозоидов органеллой и представляет собой видоизмененную лизосому, в которой заключены ферменты гидролитического характера: кислая фосфатаза, гиалуронидаза, неспецифическая эстераза, арилсультратаза etc. Особенностью акросомы является содержание в ней специфического протеолитического фермента акрозина. Предназначением акросомы является осуществление пенетрации сперматозоидом оболочек яйцеклетки для ее оплодотворения. В настоящее время принято считать, что морфологически нормальный сперматозоид должен иметь гладкую овальную головку с акросомой, составляющей 40-70% ее площади, если рассматривать спермии во фронтальной плоскости.

Таким образом, морфологически акросома представляет собой шапочку, в полости которой находятся ферменты лизосомальной природы, в частности, кислая фосфатаза. Она способствует разрушению фосфохолина и поэтому может быть необходима при прохождении спермия через желточную оболочку яйцеклетки.

Протеолитическими ферментами являются коллагеназа (110 тыс. дальтон) и специфический трипсиноподобный фермент – акрозин (30 тыс. дальтон). Одним из наиболее важных ферментов для осуществления инвазии в яйцеклетку является гиалуронидаза, имеющая молекулярный вес 62 тыс. дальтон.

При просмотре нативных препаратов оценивают агглютинацию сперматозоидов – склеивание друг с другом в отдельные конгломераты, величина которых зависит от степени выраженности агглютинации. При слабой степени агглютинации (+) склеены только единичные сперматозоиды, при средней (2+) – склеены около половины сперматозоидов лишь головками, при сильной агглютинации (3+) около половины сперматозоидов склеены как головками, так и хвостами. Агглютинация, обозначенная (4+), – массовая; склеены почти все сперматозоиды. Агглютинация сперматозоидов может наблюдаться при воспалительных заболеваниях половой сферы, сопровождающихся изменениями рН накоплением молочной кислоты, при аутоиммунизации организма антигенами тестикулярного происхождения.

Таким образом, наличие агглютинации сперматозоидов и наличие повышенного количества местно качающихся сперматозоидов является признаком наличия антисперматозоидных антител в эякуляте.

ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ

В нативных препаратах эякулята здоровых мужчин можно видеть подвижные и неподвижные сперматозоиды.

Подвижность сперматозоидов является главным критерием оценки плодовитости.

Сперматозоиды живут 18-20 часов, а в женских половых путях - до 80 часов. Нормальным сперматозоидам свойственно прогрессивно-поступательное движение: они, спирально вращаясь вокруг собственной оси, быстро движутся вперед. Подвижности сперматозоидов придается большое значение при оценке качества эякулята.

Вероятность оплодотворения снижается с уменьшением количества хорошо подвижных сперматозоидов. Большое значение для движения сперматозоидов имеет присущий им отрицательный электрический заряд, благодаря чему не происходит столкновения и слипания сперматозоидов в густом эякуляте, и они располагаются параллельно при ритмичном движении.

Сдвиг pH в кислую сторону снижает электрический заряд сперматозоидов и вызывает их агглютинацию. Агглютинация может быть также признаком аутоиммунных реакций в организме больного.

Различают следующие виды движения сперматозоидов в эякуляте:

1. прямолинейное поступательное движение со спиральным вращением вокруг своей оси,
2. манежное, или так называемое круговое прогрессивное движение; при этом движении сперматозоиды вращаются вокруг своей головки или по небольшому кругу,
3. колебательное, местное движение, когда имеется движение хвоста, но не происходит перемещения сперматозоидов.

Прогрессивное поступательное движение со спиральным вращением вокруг своей оси характеризует нормальные здоровые сперматозоиды. Многие авторы считают, что при нормоспермии должно быть 75-80% подвижных форм. Можно допустить не более 30% неподвижных форм.

Также отмечают виды патологического движения: манежное, или так называемое круговое прогрессивное движение, – сперматозоиды вращаются вокруг своей головки или по небольшому кругу, и колебательное, когда имеется движение хвоста, но не происходит перемещение сперматозоидов.

Оценка подвижности производится по общепринятой 5-балльной системе: отсутствие – 0, плохая – 1, средняя -– 2, хорошая – 3, отличная – 4. Е. Молинар (1969) оценивает подвижность также по 5-балльной системе: 0 – отсутствие движения, 1 – дергающиеся на месте сперматозоиды, 2 – вялое, почти не прогрессирующее движение, 3 – слабопрогрессирующее движение, 4 – очень быстрое целесообразное движение.

В норме подвижность 70-80% сперматозоидов должна соответствовать оценкам 3-4. Чем продолжительнее жизнь сперматозоидов (в норме 18-20 ч), тем выше их способность к оплодотворению. Для установления продолжительности движения сперматозоидов и индекса их выживаемости определяют количество подвижных сперматозоидов через 3-6 ч и более. У здоровых мужчин с нормальным сперматогенезом в среднем число двигающихся сперматозоидов уменьшается через 3 ч на 7%, через 6 ч – на 15%, а через 24 ч только 10% сперматозоидов продолжают двигаться у каждого второго мужчины. Чем глубже поражение сперматогенеза, тем меньше длительность движения сперматозоидов.

Характеристика подвижности сперматозоидов:

ПОДСЧЕТ СПЕРМАТОЗОИДОВ В 1 МЛ И ВО ВСЕМ ОБЪЕМЕ ЭЯКУЛЯТА

Разводящие жидкости для подсчета сперматозоидов:

1. 1 мл концентрированного формалина растворить в 100 мл дистиллированной воды. Для растворения слизи к этой жидкости можно прибавить 5 мг двууглекислого натрия.
2. Жидкость Рубенкова: 0,1 мл основного фуксина, 0,02 мл краски Романовского, 0,2 мл концентрированной карболовой кислоты, 0,1 мл глицерина, 2 мл 96° этилового спирта-ректификата, 100 мл 1% натрия хлорида.

Ход определения:

В пробирку вносят любую разводящую жидкость в объеме 0,4 мл, затем капиллярной пипеткой набирают 20 мкл исследуемого эякулята и выдувают на дно пробирки с разводящей жидкостью. Пипетку ополаскивают разводящей жидкостью из верхнего слоя. Полученное разведение спермы условно принимается равным 1-20. Содержимое пробирки хорошо перемешивают и заполняют камеру Горяева.

Под микроскопом (окуляр 7х, объектив 40х) подсчитывают все сперматозоиды в 5 больших квадратах, расположенных по диагонали (сосчитывают только сперматозоиды, головки которых лежат внутри квадрата).

Количество сперматозоидов в 1 мл эякулята высчитывают по формуле:

Х = (а х 4000 х 20) х 1000 / 80 = а х 1000000,

где Х – количество сперматозоидов в 1 мл эякулята, а – количество сперматозоидов, сосчитанных в 5 больших квадратах, 4000 – множитель, приводящий результат к объему 1 мкл, исходя из объема малоого квадрата (1/4000), 20 – разведение эякулята, 80 – количество малых квадратов, 1000 – множитель, приводящий результат к объему 1 мл.

Для простоты подсчета следует помнить, что найденное количество сперматозоидов в 5 больших квадратах сетки Горяева будет составлять количество сперматозоидов в миллионах в 1 мл эякулята (в млн/мл).

Общее количество сперматозоидов в эякуляте равно количеству сперматозоидов в 1 мл, умноженному на объем эякулята в мл. Количество сперматозоидов в 1 см нормального эякулята 60-120 млн.

Определение процента подвижных сперматозоидов производится также пробирочным методом: для этого в пробирки наливают 0,4 мл физиологического раствора (0,9% NaCl), подогретого до 97° С, и вносят в нее 0,02 мл эякулята. Заполняют камеру Горяева. Подсчитывают только неподвижные сперматозоиды в 5 больших квадратах. Количество неподвижных сперматозоидов в 1 мл эякулята высчитывают по формуле:

Х = (а х 4000 х 20) х 1000 / 80 = а х 1000000.

Количество подвижных форм сперматозоидов в 1 мл равно общему количеству сперматозоидов в 1 мл минус количество неподвижных сперматозоидов в 1 мл, выраженное в процентах. В 1 мл нормальной спермы содержится не менее 40% подвижных форм спермиев. Оценку подвижности также проводят в нативном препарате эякулята при ограниченном поле зрения (окошко Фонио), используя окуляр 7х и объектив 40х. Подсчитывают 100 клеток, из которых вычисляют проценты активно подвижных, малоподвижных (совершают поступательное, прямолинейное, но замедленное движение) и неподвижных сперматозоидов. В норме активно подвижные сперматозоиды составляют 80-90%, малоподвижные 10-12% и неподвижные 6-10%.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИВЫХ СПЕРМАТОЗОИДОВ СРЕДИ НЕПОДВИЖНЫХ

Реактивы:

1. 5% водный раствор эозина калия,
2. 10% водный раствор нигрозина (окрашивает только фон препарата и поэтому необязателен).

Ход определения:

На предметное стекло наносят 1 каплю эякулята, рядом вдвое большую каплю 5% раствора эозина калия и каплю 10% раствора нигрозина, вдвое большую, чем капля эозина.

Сначала эякулят смешивают с эозином, выжидают несколько секунд, затем смешивают с каплей нигрозина, опять выжидают несколько секунд и делают мазки шлифованным стеклом. При использовании иммерсионной системы микроскопа в мазках подсчитывают не менее 200 сперматозоидов, выделяя живые (бесцветные) и мертвые (окрашенные). Количество живых и мертвых сперматозоидов выражают в процентах. В норме живые сперматозоиды составляют 80-90%.

ПОДСЧЕТ СПЕРМАТОГРАММЫ

В мазках эякулята, окрашенных эозином и нигрозином или по методу Романовского, подсчитывают количество нормальных и патологических форм, выраженное в процентах. У здоровых мужчин эякулят содержит 80-100% нормальных сперматозоидов. Иногда у фертильных мужчин находят до 20% патологических форм сперматозоидов (гигантосперматозоиды, конические, с двумя головками, но с одной шейкой и одним хвостом, без хвоста, хвост без головки etc.). Однако патологические формы встречаются при бесплодии. При отсутствии сперматозоидов необходимо исследовать осадок после центрифугирования.

Для обнаружения в эякуляте клеток сперматогенеза и окончательного заключения рекомендуется исследовать окрашенный препарат. Мазок готовят следующим образом. На обезжиренные стекла, обработанные смесью Никифорова, наносят каплю осадка, тщательно растирают и сушат стекла в течение суток под стеклянным колпаком для предохранения от пыли. Высушенный в течение суток мазок фиксируют в метаноле 2 мин, потом снова высушивают и красят 8-10 мин краской Романовского (5 мин 100 мл дистиллированной воды). Препарат осторожно промывают водой, сушат и исследуют с помощью иммерсионной системы. Кроме патологических и нормальных сперматозоидов, обнаруживаются клеточные и неклеточные элементы. Часто встречаются делящиеся клетки. Незрелые половые клетки имеют округлую форму, размеры их варьируются в зависимости от степени зрелости.

Сперматогонии – интенсивно окрашенные, сравнительно мелкие (5-12 мкм), правильной формы клетки с относительно крупными ядрами, имеющими четкие очертания и равномерно зернистую структуру. Цитоплазма базофильная, окружает ядро узким ободком.

Сперматоциты – клетки более светлые, больших размеров (до 17-19 мкм в диаметре), с крупными ядрами и неравномерно расположенными в них хроматиновыми нитями. Слабобазофильная цитоплазма в виде узкого ободка располагается вокруг ядра. Размеры этих клеток и структура ядра меняются по мере созревания.

Сперматиды – самые мелкие клетки сперматогенного эпителия. Сперматиды созревают в сперматозоиды. Морфология их меняется в зависимости от степени зрелости. Ядра расположены у незрелой сперматиды центрально, затем эксцентрично, цитоплазма бледно-базофильная. В процессе созревания сперматиды и выхода сперматозоидов в эякуляте появляются безъядерные формы (резидуальные тела).

Гигантские клетки, как правило, обнаруживаются в эякуляте, содержащем большое количество клеток сперматогенеза. Они возникают из сперматид, если делению подвергаются только ядра без плазмы.

Такие клетки имеют размеры 20-22 мм и могут содержать от 2 до 22 ядер.

Спермиофаги – крупные, округлой формы клетки до 36 мкм в диаметре, содержащие одно или несколько ядер светлой, часто вакуолизированной цитоплазмы. В цитоплазме часто можно рассмотреть головки фагоцитированных сперматозоидов. Спермиофаги появляются при длительном половом воздержании или обтурации семявыносящих путей.

Клетки сперматогенеза в нормальной сперматограмме составляют не более 2%. Увеличение их числа наблюдается при бесплодии. Морфологическое исследование эякулята производят при 400-кратном и большем увеличении. Маленькую каплю убитых сперматозоидов из смесителя для лейкоцитов наносят на чистое предметное стекло и покрывают покровным стеклом. Производят подсчет процента морфологически измененных форм. Можно исследовать окрашенные препараты. Для суправитальной окраски нужно добавить к эякуляту 1% водный фильтрат бриллиантового врезилового голубого. Обращают внимание на изменение головки, шейки, хвоста. Морфограмма эякулята состоит из сперматограммы и цитограммы. В сперматограмме должны быть указаны варианты найденных патологических форм сперматозоидов, формы с чрезвычайно маленькой и необыкновенно большой головкой, переполненные или бедные хроматином, формы с обратным положением хроматина в головке с разбухшей удвоенной головкой, с изгибом и девиацией шейки, с удвоенными хвостами.

Внутри этой группы имеются физиологические вариации: юные формы с фрагментами цитоплазмы, дозревание и старые перезрелые формы, в головках которых обнаруживаются вакуоли.

При нормозооспермии встречается от 5 до 24% (в среднем 9%) морфологически измененных форм. Для окончательного заключения необходимо высчитать статистический коэффициент вариации, который определяется биометрией 500 головок сперматозоидов.

В цитограмме должны быть указаны клетки сперматогенеза (сперматоциты, сперматиды, сперматогонии, сустентоциты) и другие клеточные элементы (эпителиальные клетки, лейкоциты, эритроциты etc.).

Клеток сперматогенеза в норме должно быть не более 10%. При патологических состояниях они вовсе отсутствуют или количество их резко возрастает. Юных форм должно быть не более 2%, старых 4%.

Показатели спермограммы критерия ВОЗ характеризуют фертильный эякулят, показатели Тугебергского госпиталя характеризуют минимальную адекватность спермы, при которой возможно наступление беременности без применения вспомогательных репродуктивных технологий у 87% мужчин при условии абсолютной фертильности партнерши моложе 40 лет.

КАЧЕСТВЕННАЯ И КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕРМАТОЗОИДОВ ЭЯКУЛЯТА

Эпителиальные клетки. В нормальном эякуляте обнаруживается в небольшом количестве призматический эпителий мочеиспускательного канала. При патологических процессах в уретре в сперму могут попадать клетки многослойного плоского эпителия с ороговением из ладьевидной ямки мочеиспускательного канала. При отсутствии обтурации семявыносящего протока в эякуляте могут определяться единичные полигональные формы клеток эпителия придатка яичка диаметром от 18 до 42 мкм, с крупным ядром и обширной цитоплазмой. Реже патологический эякулят содержит эпителиальные сустентоциты. Они крупные (от 20 до 40 мкм), имеют светлое ядро угловатой формы. В их цитоплазме определяются многочисленные включения (жировые, липидные, белковые кристаллы).

Семенные кристаллы Бетхера – бесцветные, удлиненной или звездчатой формы, образуются в охлажденной сперме из фосфата. При аспермии их количество увеличивается.

Амилоидные тельца имеют овальную форму и характерное слоистое строение, напоминающее спил дерева. В норме не встречаются. Появляются при застое в предстательной железе.

Спермофаги – макрофаги, фагоцитирующие сперматозоиды. Это круглые клетки, диаметром 20-36 мкм со светлой, часто вакуолизированной цитоплазмой. Содержат одно или несколько ядер. В цитоплазме просматриваются головки, а по периферии спермофага выступают хвосты сперматозоидов.

Спермофаги обнаруживают при застое спермы (длительное половое воздержание, облитерация семявыносящего протока). Сперматофаги также появляются при аутоиммунных процессах.

Лецитиновые зерна – это мелкие бесцветные матовые зерна, в норме содержатся в значительном количестве. При простатите количество их уменьшается иногда до исчезновения; таким образом, лецитиновые зерна являются показателем степени предстательной железы, а также они являются косвенным показателем нормального количества мужских половых гормонов в организме мужчины. В нормальном эякуляте они содержатся в значительном количестве и придают ему опалесцирующий вид из-за сильного преломления света. При воспалительном процессе в предстательной железе наблюдается уменьшение числа липоидных телец с увеличением числа лейкоцитов.

Для более точного количественного определения содержания лецитиновых зерен применяется следующая методика: полученный материал вдвое разводится дистиллированной водой с добавлением 1 капли метиленового синего для лучшей дифференциации лецитиновых зерен. После тщательного перемешивания капля образованной взвеси переносится в камеру Горяева. Производится подсчет лецитиновых зерен в 100 больших квадратах, что соответствует 1600 маленьким квадратам. Для подсчета используется следующая формула:

Х = У х 4000 х 1000 х 2/1600 = У х 5000,

где Х – число лецитиновых зерен в 1 мл эякулята, У – число лецитиновых зерен в 100 больших квадратах камеры Горяева; 1600 – число малых квадратов в 100 больших; 1/4000 – объем одного малого квадрата. Для определения количества лецитиновых зерен в 1 мл эякулята (секрета простаты) необходимо число лецитиновых зерен в 1 мл камеры Горяева умножить на 5000 (Дунаевский Я. Л., 2000).

Слизь в нормальном эякуляте отсутствует. При простате или везикулите в эякулят попадает большое количество густой липкой слизи, которая обволакивает сперматозоиды.

Лейкоциты – в нормальной сперме обнаруживаются единичные клетки. При воспалительных заболеваниях придаточных половых желез и семявыносящих путей количество лейкоцитов увеличивается и могут появляться эритроциты. Подсчет лейкоцитов производится в камере Горяева одновременно с подсчетом сперматозоидов.

При этом лейкоциты исчисляются миллионами в 1 мл эякулята. При нормоспермии в 1 мл содержится до 1 млн лейкоцитов. Лейкоциты в большом количестве выявляются в эякуляте мужчин, страдающих олигозооспермией, что может указывать на наличие воспалительного процесса в половых органах.

Эякулят воспалительного характера содержит высокое количество лейкоцитов, полибластов, макрофагов.

Критерием пиоспермии является повышение концентрации лейкоцитов выше 1 млн/мл эякулята.

Посев эякулята производится при наличии пиоспермии, а также в случае идиопатического характера снижения фертильности и ухудшения показателей спермограммы и в ходе подготовки пациента для проведения вспомогательных репродуктивных технологий.

При этом бактериоспермией считается повышение концентрации бактерий выше 10³ КОЕ.

При пиоспермии показано окрашивание мазков по Граму и Цилю-Нильсену.

При обнаружении в эякуляте значительного количества лейкоцитов, эритроцитов и других патологических элементов необходимо выполнить анализ эякулята. Более чем у 90% мужчин наблюдается определенная последовательность выделения компонентов при эякуляции: преэякуляторная фракция содержит секрет желез Купера и парауретральных желез и не содержит сперматозоидов; первая эякуляторная фракция содержит секрет предстательной железы и сперматозоиды из ампулы семявыносящего протока, вторая эякуляторная фракция содержит сперматозоиды из семявыносящего протока и хвоста придатка и смесь секрета предстательной железы и семенных пузырьков, третья эякуляторная фракция практически не содержит сперматозоидов, а содержит секрет семенных пузырьков. Используя этот прием, можно установить или с большой вероятностью предположить источник эритроцитов и других патологических примесей в эякуляте.

Все перечисленные выше элементы эякулята можно подсчитать, как сперматозоиды в камере Горяева, и выразить их количество в единице объема эякулята. Это позволит врачу-клиницисту следить за эффективностью лечения воспалительных заболеваний дополнительных половых желез.

Следует различать следующие виды патологии спермы:

Аспермия характеризуется полным отсутствием в эякуляте клеток сперматогенного эпителия и сперматозоидов. Эякулят состоит только из секрета семенных пузырьков и секрета предстательной железы. Наиболее часто аспермия встречается при экскреторной форме бесплодия вследствие двусторонней обтурации семявыносящих путей.

Азооспермия – в эякуляте отсутствуют зрелые сперматозоиды, однако клетки сперматогенеза определяются.

Олигозооспермия – недостаточное количество сперматозоидов в эякуляте, снижение их концентрации менее 20 млн в 1 мл.

Считается правилом, что при наличии во всем объеме эякулята менее 40 миллионов сперматозоидов оплодотворение яйцеклетки маловероятно.

Олигозооспермия чаще всего является результатом поражения гонад секреторного характера и наблюдается при гипоплазии яичек после перенесенных тяжелых инфекций, интоксикаций, воспалительных заболеваний половых органов.

Полиспермия – повышенное содержание сперматозоидов в 1 мл эякулята, исчисляемой величиной 200 млн и более зрелых клеток.

Астенозооспермия – снижение подвижности сперматозоидов при нормальном их общем количестве в эякуляте; количество подвижных клеток не менее 50%.

Тератозооспермия – наличие в эякуляте большого количества дегенеративных форм сперматозоидов, более 50%.

Некрозооспермия – в эякуляте обнаруживаются в достаточном количестве сперматозоиды, утратившие жизнеспособность и подвижность. Некрозооспермия наблюдается при воспалительных заболеваниях придатков, семенных пузырьков, может быть результатом воздействия вредных факторов внешней среды, дизритмии половой жизни.

Пиоспермия – увеличение количество лейкоцитов в эякуляте свыше 8-10 в поле зрения, наблюдается при инфекционно-воспалительных заболеваниях половых путей.

Гемоспермия – наличие крови в семенной жидкости. В зависимости от места попадания крови в сперму эякулят приобретает различный цвет – от бурого оттенка при попадании крови на уровне придатка, семенного пузырька или простаты (истинная гемоспермия), до окраски алой кровью из задней уретры (ложная гемоспермия).

Гипоспермия и гиперспермия – этими терминами обозначают изменения количества семенной жидкости, когда наблюдаются либо уменьшение объема эякулята менее 1 мл, либо увеличение более 6 мл.

Асперматизм – полное отсутствие эякулята при половом акте с сохранением полового влечения и возбуждения. Истинный асперматизм связывают с нарушением функции периферической и центральной нервной систем, в результате чего страдают копулятивная и генеративная функции. Ложный асперматизм может быть следствием рубцовых изменений предстательной железы, семявыносящих протоков, задней уретры, приводящих к извержению семени в мочевой пузырь. В этом случае в семенниках сохраняется нормальный сперматогенез.

В литературе могут встречаться некоторые расхождения в толковании терминологии эякулята. Так, в соответствии с рекомендациями всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в англоязычной литературе варианты образцов спермы систематизируются следующим образом:

Нормозооспермия – нормальный эякулят.

Олигоспермия – концентрация сперматозоидов меньше 20 х 10⁶ или 40х10⁶ в эякуляте.

Тератозооспермия – меньше 50% сперматозоидов с нормальной морфологией.

Астенозооспермия – меньше 50% сперматозоидов с прогрессивным движением вперед.

Некрозооспермия – подвижных сперматозоидов нет.

Олигоастенотератозооспермия – сочетание всех трех вариантов.

Полизооспермия – количество сперматозоидов больше 200х10⁶ мл.

Азооспермия – сперматозоидов в эякуляте нет.

Аспермия – нет эякулята.

Наряду с изучением морфологических и физиологических свойств семенной жидкости проводится исследование ее биохимического состава, что важно для понимания патологии сперматогенеза.

БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЯКУЛЯТА

Изучение биохимического состава эякулята, наряду с исследованием его физиологических и морфологических свойств, является важным для понимания вопросов, связанных с физиологией и патологией сперматогенеза.

В состав семенной жидкости человека входит большое количество неорганических и органических веществ (углеводов, липидов, белков, свободных аминокислот, гормонов, витаминов, ферментов). От содержания этих компонентов в определенной мере зависит оплодотворяющая способность сперматозоидов. Однако до настоящего времени биохимический состав спермы и происходящие в ней процессы изучены недостаточно. Наибольшее практическое значение имеет определение фруктозы, фруктолиза и лимонной кислоты в эякуляте.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФРУКТОЗЫ И ФРУКТОЛИЗА

Образование фруктозы происходит в семенных пузырьках. За счет расщепления фруктозы (фруктолиза) получается энергия, необходимая для жизненных процессов сперматозоидов.

Фруктоза образуется только при достаточной гормональной функции гландулоцитов. Потребление фруктозы зависит от числа сперматозоидов, их подвижности и способности к фруктолизу. Средняя концентрация фруктозы в эякуляте равна или превышает 14 ммоль/л. Значительное понижение содержания фруктозы (менее 7 ммоль/л) указывает на недостаток андрогенов.

Ход определения:

0,5 мл спермы тщательно смешивают с 7,5 мл дистиллированной воды, затем при помешивании прибавляют 1 мл 10% раствора цинка сульфата и 1 мл 0,5 н. раствора натрия гидроксида. Пробирку на 1 мин погружают в кипящую водяную баню для лучшей коагуляции белка, затем фильтруют. К 2 мл фильтрата прибавляют 2 мл 0,1% спиртового раствора резорцина и 6 мл 30% соляной кислоты. Ставят на 8 мин в водяную баню при температуре +80° С.

Наступает стойкое окрашивание. Экстинкцию исследуемого раствора определяют в фотокалориметре при длине волны 250 нм в сравнении с контрольной пробой, которая вместо спермы содержит 0,5 мл дистиллированной воды. Количество фруктозы определяют от калибровочной кривой, составленной на основании анализа кристаллической фруктозы (Бокуняева Н. И., 1975).

Для определения фруктолиза производят повторное исследование через 2 ч по указанной выше методике. Разница между первым и вторым исследованиями показывает величину фруктолиза.

Лимонная кислота образуется в предстательной железе.

В норме концентрация лимонной кислоты в сперме может служить своеобразным "андрологическим эквивалентом" эндокринной функции яичек.

Концентрация лимонной кислоты в эякуляте служит также показателем функционального состояния предстательной железы.

В норме концентрация лимонной кислоты в семенной жидкости колеблется от 2 до 3 ммоль/л. При простатите концентрация лимонной кислоты может значительно уменьшаться.

Ход определения:

Определение лимонной кислоты начинают с осаждения белков. В колбочке на 25-50 мл или в широкой (сахарной) пробирке к 0,4 мл эякулята добавляют 7,6 мл дистиллированной воды и 4 мл 60% трихлоруксусной кислоты, встряхивают в течение 10 мин. При необходимости колбочку с содержимым можно оставить при комнатной температуре до следующего дня. Смесь фильтруют. Фильтрат должен быть прозрачным. К 3 мл фильтрата добавляют 1 мл 15 н. раствора серной кислоты, 0,8 мл 0,3 М калия перманганата, 0,2 мл 1 М калия бромида, тщательно перемешивают и оставляют на 15 мин в вытяжном шкафу.

Затем избыток калия перманганата удаляют добавлением 0,5 мл 1,5 М натрия нитрата и в полученную бесцветную жидкость для освобождения от избытка натрия нитрата доливают 0,5 мл 2 М раствора мочевины.

Обесцвеченные пробы переносят в делительные воронки. Туда же вливают 10 мл петролейного эфира или гексана. При встряхивании в течение 1 мин экстрагируют пентабромацетон – продукт окисления лимонной кислоты. Нижний слой сливают и также при встряхивании реакционную смесь промывают 5 и 3 мл дистиллированной воды. В промытый петролейный эфир добавляют 5 мл реактива (натрия сульфид в этиленгликоле).

После добавления реактива жидкость встряхивают в течение 1 мин. Через 10 мин окрашенную жидкость вливают и определяют оптическую плотность на фотоколориметре, используя светофильтр с длиной волны пропускания около 430 нм. Расчет производят по калибровочной кривой. Для ее построения из стандартного раствора лимонной кислоты берут такие количества, которые содержат от 100 до 500 мкг, разливают в пробирки по 3 мл. Далее определение лимонной кислоты ведут, как и в фильтрате эякулята, после осаждения белков (Базарнова М. А. и др., 1979).

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выявление антисперматозоидных антител. Сперматогенный эпителий хорошо защищен от инфекционных и токсических воздействий гематотестикулярным барьером, который нарушается в исключительных случаях. Повреждение проницаемости или структуры этого гематотестикулярного барьера, образованного собственной оболочкой семенных канальцев и цитоплазмой сустентоцитов, играет существенную роль в патогенезе аутоиммунного бесплодия.

Антитела у самцов скапливаются в сперматогенном эпителии, нарушая тем самым процессы сперматогенеза. Различают три вида антител: сперматоагглютинирующие, сперматоиммобилизирующие и сперматогенные. Эти антитела вызывают агглютинацию и иммобилизацию сперматозоидов, а также деструктивные изменения в сперматогенной ткани. Антигены содержатся не только в сперматозоидах, но и в сперме. Следовательно, сперма может вызвать появление в организме антител не только к сперматозоидам, но и к сперме.

Определение спермагглютинирующей активности сывороток крови методом микроспермагглютинации (Франклин, Декс, 1984).

1. Инактивация комплемента расследуемой сыворотки нагреванием при 56° С в течение 30 мин.

2. Двухкратное разведение сыворотки крови изотоническим раствором натрия хлорида в объеме 0,5 мл от 1:2 до 1:256.

3. Доведение концентрации сперматозоидов в эякуляте, используемом в качестве антигена, до 50 х 10⁶ мл (добавляют изотонический раствор натрия хлорида).

4. Добавление антигена суспензии сперматозоидов (0,05 мл) к серийным двухкратным разведениям сыворотки крови.

5. Инкубация при температуре 37° C в течение 1 ч.

6. Учет результатов под микроскопом.

Реакция положительная при наличии 10% агглютинированных сперматозоидов и более. Отмечается тип агглютинации (хвост к хвосту, головка к головке или смешанный).

Определение спермагглютинирующей активности сыворотки крови методом макроспермагглютинации (Кибрик С. и др., 1952).

1. Инактивация комплемента исследуемой сыворотки крови путем нагревания при температуре 56° С в течение 30 мин.

2. Приготовление антигена. Доведение содержания сперматозоидов до 50 х 10⁶ мл путем добавления к исходному количеству половых клеток в эякуляте изотонического раствора натрия хлорида и равного объема 10% раствора желатина.

3. Двухкратные разведения исследуемой сыворотки изотоническим раствором натрия хлорида в объеме 0,2 мл в преципитационных пробирках от 1:2 до 1:256.

4. Добавление к разведениям исследуемой сыворотки крови равного объема сперматозоидно-желатиновой смеси.

5. Инкубация при температуре 37° C в течение 2 ч.

6. Макроскопический учет результатов реакции.

Агглютинация проявляется образованием хлопьев в прозрачной среде суспензии.

Определяется титр спермагглютинирующей активности.

Определение спермиммобилизирующей активности сыворотки крови (Изоджима С. и др., 1968).

1. Инактивация комплемента исследуемой сыворотки нагреванием при температуре 50° С в течение 30 мин.

2. Приготовление антигена. Доведение концентрации сперматозоидов до 50 х 10⁶ мл (добавляют изотонический раствор натрия хлорида).

3. Добавление 0,25 мл раствора антигена в присутствии 0,05 мл раствора комплемента – сыворотки крови АВ (IV) группы и без него к 0,25 мл исследуемой сыворотки крови.

4. Инкубация исследуемой сыворотки при температуре 37,5° C в течение 1 ч.

5. Оценка реакции: определение содержания (в процентах) подвижных сперматозоидов в каждой пробирке.

Уменьшение их количества в исследуемой сыворотке крови на 50% и более в присутствии комплемента расценивается как положительная реакция.

Микроагглютинация по Баскину. Полагают, что при половых сношениях происходит резорбция специфических ферментов сперматозоидов. Против всосавшихся ферментов в организме женщины образуются антиферменты (ингибиторы), которые подавляют подвижность сперматозоидов мужа. Очевидно, название реакции микроагглютинации неверно, так как никакой агглютинации здесь не происходит.

Ход исследования. У обследуемой женщины берут 3-4 капли крови из вены и сразу центрифугируют для получения сыворотки. Суспензию сперматозоидов мужа и другого мужчины с плодовитой спермой (контроль) готовят одинаково. Центрифугируют и осадок разводят изотоническим раствором натрия хлорида так, чтобы в 1 мл суспензии содержалось 2 млн сперматозоидов. Готовят 4 препарата на предметных стеклах: 1-й препарат – наносят каплю сперматозоидов мужа. 2-й препарат – наносят каплю суспензии сперматозоидов другого мужчины. 3-й препарат – наносят каплю сыворотки обследуемой женщины и каплю суспензии сперматозоидов мужа. 4-й препарат – наносят каплю сыворотки крови исследуемой женщины и каплю суспензии сперматозоидов другого мужчины (контроль). Капли перемешивают, покрывают покровными стеклами, которые по краям парафинируют и ставят в термостат при температуре 37° С на 6 ч. Через каждые 30 мин определяют подвижность сперматозоидов под микроскопом.

Проба положительна, если в препарате 3 уменьшается процент кинеза сперматозоидов значительнее, чем в остальных контрольных препаратах. Чем выше титр иммобилизации ингибирующих антител, тем быстрее понизится процент кинеза и наступит полная иммобилизация сперматозоидов, тем резче положительная проба и менее вероятно оплодотворение.

Биологические пробы. Проба на совместимость и регенерационную способность сперматозоидов. Если возникают сомнения в совместимости шеечной слизи и спермы, то применяют пробу Шуварского, модифицированную Гунером.

Обследуемая женщина приходит через 1-2 ч после полового акта, которому предшествовало воздержание от половой жизни в течение 4-5 дней.

Берут каплю содержимого из шеечного канала и влагалища. При положительной пробе Шуварского-Гунера в шеечной слизи можно определить от 5 до 15 подвижных сперматозоидов и более. Отсутствие сперматозоидов или их подвижности в шеечной слизи указывает на отрицательную пробу. При отрицательной пробе Шуварского-Гунера необходимо поставить пробу Курцрока-Миллсра. Эту пробу проводят в срок предполагаемой овуляции. Для этого на предметное стекло помещают каплю свежей спермы диаметром 3 мм и такую же каплю шеечной слизи. Расстояние между каплями должно быть 3 мм.

Капли покрывают покровным стеклом. При положительной пробе сперматозоиды проникают через границу слизи, при отрицательной этого явления не наблюдается.

Чтобы выяснить причину отрицательного результата анализа при исследовании эякулята или секрета пользуются перекрестным пенетрационным тестом по Буво и Пальмеру. Исследуемый эякулят мужа соединяют с секретом посторонней женщины. Если сперматозоиды проникают в этот секрет, то причиной бесплодия являются патологические изменения у жены. Если секрет жены приводится в соприкосновение со спермой постороннего мужчины и его сперматозоиды проникают в этот секрет, то больным является муж. Если оба теста дают отрицательный результат, то к бесплодному браку причастны оба супруга, то есть имеется неполноценность как сперматозоидов, так и секрета влагалища.

После исследования состояния сперматогенеза, определения патоспермии устанавливается клинический диагноз и определяется лечебная тактика.